噬菌體篩選是廣泛發(fā)現(xiàn)高通量抗體的篩選方法

　　噬菌體篩選是廣泛的高通量抗體發(fā)現(xiàn)的篩選方法，其實質(zhì)是親和力測定方法的一種變種，其目的是需要建立ELISA信號值和樣品親和力大小之間的正相關(guān)性。相對于采用ELISA進(jìn)行抗體的親和力測定方法，用于雜交瘤和噬菌體展示篩選的ELISA方法有以下難點：
 

　　1.待測樣本多樣性，且單一樣品通常也是混合物，有很大的可能存在非特異吸附；
 

　　2.不同的待測樣品之間可能存在較大的濃度差異，濃度的大小和親和力的大小均會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。在進(jìn)行雜交瘤和噬菌體展示篩選方法開發(fā)時，需要選擇合適的條件使信號值主要能夠表征親和力的大小而一定程度上忽略濃度差異造成的影響。
 

　　噬菌體篩選實驗步驟：
 

　　1.將每輪篩選洗脫的噬菌體用來感染新鮮的XLIBlu菌，以10μl、20μl等不同量菌液涂于LB氨芐青霉素平皿，37℃4~5h。
 

　　2.事先將硝酸纖維素膜在5mmol/L的IPTG溶液中浸泡10min，在超凈臺中晾干后，鋪在上述涂有細(xì)菌的平皿中，注意膜面與平皿中培養(yǎng)基界面應(yīng)無氣泡。
 

　　3.置30℃過夜培養(yǎng)，一般約15~16h。
 

　　4.作好標(biāo)記，輕輕地將硝酸纖維素膜揭開，用氯仿熏蒸固定15min。
 

　　5.將膜置于溶菌酶緩沖液中(50mmol/LTrispH值8.0，150mmol/LNaCl，5mmol/LMgCl2，BSA3g，溶菌酶40mg，100UDNAase)，每張膜用20~25ml緩沖液，置平皿于小型搖床中，室溫阻斷1h。
 

　　6.換上述新鮮阻斷緩沖液，室溫反應(yīng)1h。
 

　　7.對硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫酶染，方法如常規(guī)方法，根據(jù)實驗需要可選擇以下幾種策略：
 

　　1)辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)直接標(biāo)記抗原蛋白檢測；
 

　　2)用HRP或AP標(biāo)記的抗人或抗鼠Fab抗體檢測；
 

　　3)加入特異性抗原步驟一，加酶標(biāo)單克隆抗體或抗血清步驟二；
 

　　4)加入特異性抗原步驟一，加單克隆抗體或抗血清步驟二，加酶標(biāo)二抗步驟三。
 

　　根據(jù)實驗需求而決定，策略2)比較簡單，但僅是針對Fab抗體的檢測，挑到表達(dá)Fab抗體的陽性克隆后需進(jìn)一步鑒定是否有某種抗原特異性。
 

　　8.對照硝酸纖維膜與相應(yīng)平皿，挑取單個陽性克隆，置4mlSBA培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，菌液留作菌種，以備后用。