蛋白純不純？選對(duì)方法很重要

蛋白質(zhì)是生物體的基本組成成分，是生命功能的執(zhí)行者。深入研究某種蛋白的功能及作用機(jī)制，對(duì)蛋白在醫(yī)藥、工業(yè)、科研等方面的應(yīng)用具有重要價(jià)值。而要研究某一個(gè)特殊的蛋白，就要先將這個(gè)蛋白從生物體中分離純化出來(lái)。蛋白純化在蛋白工程中是很重要的一步，從研究蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，到對(duì)蛋白進(jìn)行修飾改造，以及最后批量開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，首先都需要獲得單一的蛋白。

蛋白純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物質(zhì)中分離純化出所需要得目的蛋白的方法，在蛋白質(zhì)研究中起到橋梁作用，成為當(dāng)代生物技術(shù)行業(yè)的核心。蛋白純化工作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，但又十分重要。

蛋白純化總原則：

以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白分離出來(lái)，同時(shí)保留其生物學(xué)活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)完整性。

蛋白純化方法

純化依據(jù)——蛋白不同的理化性質(zhì)（如分子大小、分子形狀、帶電特性、溶解特性、吸附性質(zhì)、與配體的特異性結(jié)合、變性和復(fù)性等）。

常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)有膜分離技術(shù)、沉淀分離技術(shù)、電泳分離技術(shù)以及層析分離技術(shù)等。目前層析技術(shù)是蛋白純化領(lǐng)域的核心技術(shù)，也是應(yīng)用最多最為廣泛的技術(shù)。

層析分離技術(shù)是根據(jù)被分離物與層析固定相之間的物理化學(xué)性質(zhì)以及生物學(xué)性質(zhì)的相互作用來(lái)進(jìn)行分離。層析法的種類繁多，應(yīng)用較為廣泛的有凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水層析以及親和層析。

不同的蛋白特性對(duì)應(yīng)不同的純化方法：

分子大小——凝膠過(guò)濾層析

帶電性——離子交換層析

疏水性——疏水層析

配體特異性——親和層析

蛋白純化標(biāo)簽

在蛋白純化過(guò)程中，經(jīng)常通過(guò)添加合適的標(biāo)簽輔助蛋白純化，促進(jìn)蛋白可溶性。

常用的幾種蛋白純化標(biāo)簽比較：

His，蛋白純化當(dāng)選標(biāo)簽，分子量小，對(duì)蛋白無(wú)影響，能純化可溶性/包涵體蛋白。

GST，增強(qiáng)蛋白可溶性，僅能純化可溶性蛋白，屏蔽毒性蛋白，標(biāo)簽較大。

MBP，增強(qiáng)蛋白可溶性，屏蔽毒性蛋白，標(biāo)簽較大，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)/功能會(huì)有一定影響。

Myc，高特異性，在天然洗脫條件下，使用Myc標(biāo)簽多肽來(lái)與重組蛋白進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，可溫和洗脫Myc標(biāo)簽蛋白質(zhì)。

SUMO，增強(qiáng)蛋白可溶性，切割特異性*，不殘留任何氨基酸，適合重組蛋白表達(dá)。

Strep，不會(huì)影響標(biāo)簽蛋白的功能結(jié)構(gòu)，更簡(jiǎn)便，適合高純度蛋白產(chǎn)出。

Flag，通常不與目的蛋白相互作用，純化效率高，應(yīng)用廣泛。

當(dāng)然，有時(shí)我們需要根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)的需求將添加的蛋白標(biāo)簽去除，這時(shí)就要靠工具酶了?

標(biāo)簽切除蛋白酶：

Thrombin（Leu-Val-Pro-Arg▼Gly-Ser），

Enterokinase（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys▼），

rTEV（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln▼Gly）。